Atlas de traducción y descomposición de ARNm para bacterias

Nature Microbiology volumen 8, páginas 1123–1136 (2023) Citar este artículo

7989 Accesos

150 Altmetric

Detalles de métricas

La regulación de la estabilidad del ARN mensajero es fundamental para la expresión génica programada en bacterias y se logra mediante una miríada de mecanismos moleculares. Mediante la secuenciación masiva de los intermedios de descomposición del ARNm monofosforilado en 5 '(5'P), mostramos que la degradación del ARNm cotraduccional se conserva entre las bacterias Gram-positivas y -negativas. Demostramos que, en especies con exonucleasas 5′–3′, la exoribonucleasa RNase J rastrea el ribosoma final para producir una huella de un solo nucleótido in vivo de la posición 5 'del ribosoma. En otras especies que carecen de exonucleasas 5′–3′, el posicionamiento de los ribosomas altera los sitios de escisión endonucleolítica. Utilizando nuestro enfoque de secuenciación del metadegradoma (degradoma 5′P), caracterizamos los intermedios de descomposición del ARNm 5′P en 96 especies, incluidas Bacillus subtilis, Escherichia coli, Synechocystis spp. y Prevotella copri e identificar las respuestas de estancamiento de los ribosomas a nivel de codones y genes al estrés y al tratamiento farmacológico. También aplicamos la secuenciación 5′P a microbiomas clínicos y ambientales complejos y demostramos que la secuenciación del metadegradoma proporciona una caracterización postranscripcional rápida y específica de la especie de las respuestas a las perturbaciones ambientales o de drogas. Finalmente, producimos un atlas de degradoma para 96 ​​especies para permitir el análisis de los mecanismos de degradación del ARN en bacterias. Nuestro trabajo allana el camino para la aplicación de la secuenciación de metadegradomas a la investigación de la regulación postranscripcional en especies no cultivables y comunidades microbianas complejas.

La degradación y la traducción del ARN mensajero (ARNm) están estrechamente relacionadas, y los cambios en la dinámica de los ribosomas modulan directamente la estabilidad del ARN mensajero1,2,3,4. En eucariotas, la síntesis de proteínas y la descomposición del ARNm están conectadas por la exonucleasa 5′–3′ Xrn1, que sigue al último ribosoma de traducción y produce una huella in vivo de su posición5,6. La degradación del ARN en bacterias permite la adaptación a entornos cambiantes, pero nuestra comprensión de la degradación del ARN en bacterias se ha visto obstaculizada por la diversidad de mecanismos de degradación del ARN. Se pensaba que la degradación del ARN bacteriano se iniciaba a través de la escisión endonucleolítica seguida de la degradación 3′–5′7,8,9,10. Aunque se ha informado sobre la actividad exonucleolítica del ARN 5′–3′ de la ARNasa J en Bacillus subtilis11 y sus homólogos en otras especies9, y se sabe que la eficiencia de la traducción modula la estabilidad del ARNm en bacterias3,12, no entendemos cómo la degradación cotraduccional del ARNm da forma a la bacteria. degradome o si este proceso difiere en especies con maquinaria de degradación de ARNm divergente.

Para comprender mejor la regulación de la biología del ARN en las bacterias, investigamos la degradación del ARNm en cepas bacterianas de referencia y microbiomas complejos utilizando secuenciación intermedia (degradoma) de ARNm monofosforilado en 5' (5'P) optimizada (5PSeq). Exploramos el grado en que el 5′P natural refleja la dinámica de los ribosomas in vivo y caracterizamos el degradoma 5′P en respuesta al estrés ambiental y al tratamiento farmacológico en cepas de referencia y cultivos fecales complejos. Analizamos los patrones de degradación del ARNm en 96 especies cultivables y no cultivables, incluido el organismo modelo B. subtilis, e informamos nuestros hallazgos aquí.

Analizamos el degradoma de ARNm de 5′P en especies individuales y comunidades bacterianas complejas utilizando 5PSeq)5,13,14,15 optimizado (Tablas complementarias 1 y 2 y Métodos). Primero investigamos el degradoma 5′P de marcos de lectura abiertos (ORF) en especies con decaimiento 5′–3′. B. subtilis codifica la exonucleasa 5′–3′ RNase J11. Aunque la RNasa J no es homóloga al XRN1 eucariótico, planteamos la hipótesis de que, a través de su actividad de exonucleasa 5′–3′, podría 'perseguir' el último ribosoma de traducción en los ARNm que experimentan una descomposición cotraduccional, similar al XRN1 en la levadura5,16. Nuestro análisis reveló una periodicidad de 3 nucleótidos (nt) de recuentos de 5′P (Fig. 1a) con una preferencia de 5′P por el segundo nucleótido de cada codón (F1), tanto a nivel de metagen como de gen único (Fig. 1a y datos extendidos Fig. 1a). Los intermedios de degradación de 5'P acumulan 11 y 14 nt aguas arriba de los sitios de inicio y finalización de la traducción, respectivamente, como se esperaba de los ribosomas de inicio y terminación lentos. Este patrón es análogo a los sitios –14 nt desde el inicio y –17 nt desde el final en la levadura en ciernes5,15. Este tamaño de protección de 3 nt más pequeño puede explicarse por la diferencia conocida en el tamaño de los ribosomas entre eucariotas y bacterias17. Confirmamos la asociación de los intermedios de descomposición de 5'P con la traducción de los ribosomas mediante la aplicación de 5PSeq a fracciones polirribosomales de gradientes de densidad de sacarosa, y observamos patrones similares (Datos extendidos, Fig. 1b). Para demostrar su origen biológico, confirmamos que la fragmentación in vitro del mismo ARN eliminó la periodicidad de 3 nt observada in vivo en >99,5 % (la señal de la transformada rápida de Fourier (FFT, por sus siglas en inglés) se redujo a 0,11) y por las huellas de los pies asociadas a inicio/parada (Fig. .1a). Finalmente, para investigar si la RNasa J tiene un papel en este proceso, repetimos el análisis en una cepa con deleción de RNasa JA (rnjA) de B. subtilis. Esto reveló que la actividad de la RNasa JA sustenta el patrón de distribución 5'P observado que resulta de la degradación cotraduccional del ARNm (Fig. 1b).

a, metarrecuentos (5PSeq lecturas por millón (RPM)) de las posiciones de mapeo 5' en relación con los sitios de iniciación y terminación de la traducción de los ORF de B. subtilis. Se muestran los controles sin tratamiento (NT) (verde), tratados con CAM (amarillo) y fragmentados aleatoriamente (en rojo). Las RNasas identificadas se resaltan en la esquina superior derecha (las no identificadas se colorean en gris claro). Se informan las posiciones originales de 5PSeq (no se aplicó la corrección del sitio P). También se muestran FFT para la periodicidad observada y un histograma que representa la protección relativa del marco 5PSeq para todos los codones. b, metarrecuento de 5′P para la cepa ∆rnjA, como en a. c, Preferencia de motivo de escisión en sitios 5′P y ± cuatro bases para especies representativas de los filos Bacillota, Cyanobacteria, Pseudomonadota y Bacteroidota, calculada con la medida de contribución de nucleótidos basada en la entropía de Shannon tal como se implementa en el paquete R ggseqlogo64. A la derecha, se destaca la presencia de RNasas identificadas en cada especie. RNE/G (proteínas de la familia de ribonucleasas E/G) indica la presencia del dominio catalítico conservado entre ambas ribonucleasas. EPA, sitios de unión de ARNt E, P y A en el ribosoma.

A continuación, investigamos especies con o sin exonucleasas de ARN 5'–3' anotadas en su genoma (Datos ampliados Fig. 2)9 para evaluar el papel de otras nucleasas en la degradación del ARNm. Primero, probamos Bacillota (Bacillus amyloloquefaciens, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri), Cyanobacteria (Synechocystis sp. PCC 6803) y Pseudomonadota (Caulobacter crescentus), todos los cuales codifican RNase J. Observamos un claro patrón de periodicidad de 3 nt a lo largo de toda la longitud regiones de codificación, con lecturas de 5′P que se acumulan con frecuencia en el segundo nucleótido (F1) de cada codón y 11 y 14 nt aguas arriba de los codones de inicio y parada, respectivamente (Datos extendidos Fig. 2), como se observa para B. subtilis (Fig. .1a). Curiosamente, en Synechocystis sp. PCC 6803, el patrón de protección del ribosoma fue desplazado por un nucleótido adicional (es decir, acumulación a –12 nt desde el inicio y –15 nt desde los codones de terminación) (Datos extendidos Fig. 2d). Esto podría explicarse por un tamaño o conformación diferente de la protección del ribosoma, o por la presencia de cofactores potenciales18,19. También probamos especies de Pseudomonadota, incluidas Escherichia coli (DH5α y MG1655) y Bacteroidota anaerobia (Alistipes finegoldii, Prevotella copri, Prevotella timonensis y Parabacteroides merdae), ninguna de las cuales tiene actividad de exonucleasa 5'–3'. Observamos un patrón de periodicidad de 3 nt en los Bacteroidota estudiados, que tienen homólogos de la familia de proteínas RNE/G (RNE/G)20 y RNasa Y. En E. coli, que tiene RNasa E en lugar de RNasa Y, observamos una sutil periodicidad de 3 nt (Datos extendidos Fig. 2f) que fue menos notable en la cepa MG1655, donde se acumulan menos lecturas de 5′P en la región de codificación (Datos extendidos Fig. 2g). A diferencia de las especies con exonucleasa 5'–3', las que carecen de RNasa J acumulan sitios endonucleolíticos 5'P alrededor de los codones de inicio y terminación. Además, observamos la escisión de 5'P superpuesta al propio codón de inicio en la mayoría de las especies, y diferente de la protección esperada del ribosoma a 11 nt aguas arriba. La escisión asociada con el codón de inicio fue particularmente clara en C. crescentus. Proponemos que existe una relación entre el inicio de la traducción y la descomposición del ARNm, donde las escisiones endonucleolíticas a menudo ocurren en los codones de inicio (Datos extendidos Fig. 2).

La periodicidad de 3 nt observada podría haberse originado a partir de la huella de un solo nucleótido in vivo de 5'–3' de la posición del ribosoma, como se informó en eucariotas5. Alternativamente, podría ser una consecuencia de la interacción entre las preferencias de escisión específicas de la endonucleasa, la accesibilidad diferencial del ARNm y la distribución no aleatoria de nucleótidos a lo largo de las regiones codificantes. El trabajo anterior ha investigado la preferencia de secuencia de RNase E21,22 y RNase Y23,24 en especies seleccionadas, por lo que optamos por incluir un conjunto diverso de especies con diferente maquinaria de degradación de ARN para ampliar el alcance de las especies cubiertas (Fig. 1c). La presencia de RNasa J y E sin Y en Synechocystis sp.25 y C. crescentus se asocia con intermediarios de degradación de ARNm 5′P con preferencia por una A precedida por una U (–1 U/+1 A). La presencia de homólogos de proteína RNasa Y y RNE/G en Bacteroidota sugiere una preferencia por +1 A. En Bacillota, donde domina la actividad exonucleolítica 5'–3', los intermedios de degradación de ARNm 5'P presentan motivos de secuencia más homogéneos. Es factible que la RNasa J recorte los sitios de escisión generados endonucleolíticamente. De acuerdo con esta hipótesis, surge una preferencia 5′P por A en el mutante por deleción rnjA de B. subtilis (Datos ampliados, Fig. 3a), similar a Bacteroidota, donde la endonucleasa RNasa Y es el principal impulsor de la descomposición del ARN (Fig. 1c)26 ,27. Probamos el efecto de las eliminaciones de RNase JB (rnjB) y RNase Y (rny) en B. subtilis y descubrimos que su contribución al patrón observado fue mínima (Datos extendidos Fig. 3a). Curiosamente, al realizar el mismo análisis después del choque térmico (HS), observamos un claro aumento en la preferencia de +1 G en todas las muestras (Datos extendidos, Fig. 3b). Esto sugiere que la interacción entre las RNasas y la posición ribosómica es dinámica y que puede alterarse en respuesta a los desafíos ambientales. También probamos si la expresión heteróloga de Streptococcus pyogenes rnjA fue suficiente para alterar el patrón endonucleolítico observado en E. coli. Sin embargo, incluso cuando rnjA se expresó a nivel de ARNm medido por 5PSeq, el patrón (–1 U/+1 A/+3 G) se mantuvo (Datos ampliados Fig. 3c), lo que sugiere que la actividad de la RNasa E aún domina la descomposición del ARNm. Para confirmar que los patrones observados son causados ​​por mecanismos biológicos, demostramos una pérdida de la preferencia 5′P luego de la fragmentación de ARN in vitro en muestras de B. subtilis y E. coli (Datos extendidos Fig. 3a, c). Llegamos a la conclusión de que la preferencia de secuencia de los intermedios de degradación del ARNm de 5'P presentes de forma natural se conserva en especies relacionadas filogenéticamente y está determinada por la diafonía entre las vías de degradación del ARN.

Para investigar cómo los ribosomas afectan la distribución de 5′P, perturbamos la dinámica de los ribosomas usando cloranfenicol (CAM). Cuando los ribosomas se estancaron en el alargamiento, observamos un aumento del patrón de protección de ribosomas de 3 nt en B. subtilis, L. plantarum, L. reuteri y B. amyloliquefaciens (Fig. 1a y Extended Data Fig. 2a,c). También observamos un exceso relativo de intermedios de degradación de 5′P alrededor de las regiones 5′ de los ORF y una disminución en la protección alrededor de las regiones 3′, consistente con la inhibición específica del alargamiento de la traducción en lugar de la iniciación o terminación17. La acumulación de 5'P en las regiones 5' de los ORF también fue evidente en especies sin actividad de exonucleasa 5'–3', en las que no se puede esperar que la actividad endonucleolítica proporcione información de resolución de un solo nucleótido con respecto a la posición del ribosoma (Datos extendidos Fig. 2f– k). Nuestros resultados sugieren que el estancamiento de los ribosomas después del tratamiento con CAM puede limitar la accesibilidad in vivo de las endonucleasas y afectar el degradoma de ARNm de 5'P. A continuación, consideramos si la abundancia de intermediarios de desintegración del ARNm de 5′P podría servir como un indicador de las pausas de ribosoma específicas de codón en especies que contienen RNasa J. Al alinear las lecturas de 5′P con cada aminoácido respectivo, generamos un metagen específico de aminoácido. perfiles (Fig. 2 y Datos extendidos Fig. 4). En L. plantarum esto mostró una clara acumulación de 5′P asociada con ribosomas lentos en los codones de parada y Cys, probablemente asociados con disponibilidad limitada de Cys libre en el medio de crecimiento (Fig. 2a)28,29. A continuación, perturbamos el proceso de traducción y probamos los efectos sobre la acumulación de 5′P. Primero, probamos nuestra capacidad para detectar pausas específicas de codón después de 10 minutos de tratamiento con mupirocina (MUP), un antibiótico que se dirige a la sintetasa de ARNt de Ile. El tratamiento con MUP condujo a paradas de ribosomas en los codones de Ile y una acumulación clara de lecturas de 5′P 14 nt aguas arriba de las de L. plantarum, L. reuteri y B. subtilis (parada en el sitio A; Fig. 2a y Datos extendidos Fig. 4a ). Esto sugiere que las posiciones de los ribosomas dan forma al degradoma bacteriano. A continuación, investigamos las pausas específicas de codón asociadas con el tratamiento de CAM de 5 min en B. subtillis, L. plantarum, L. reuteri y B. amyloliquefaciens (Fig. 2a,b y Extended Data Fig. 4b). Además de una inhibición general de la elongación de la traducción, la CAM también conduce a una acumulación de ribosomas30,31 específica del contexto. Concretamente, se ha informado anteriormente que el tratamiento con CAM de E. coli aumenta el estancamiento de los ribosomas cuando Ala (y, con menos frecuencia, Ser, Thr o Gly) se coloca en el sitio E. Usando 5PSeq, también identificamos el bloqueo de ribosomas inducido por CAM 8 nt aguas arriba de Ala y Ser en las especies probadas con RNase J (Fig. 2a, b y Extended Data Fig. 4b). Llegamos a la conclusión de que los puestos de ribosomas específicos del contexto después del tratamiento CAM se conservan en bacterias. Además, nuestros resultados muestran que las firmas 5′P se pueden usar como indicadores moleculares para antibióticos que se dirigen al proceso de traducción en especies con RNasa J.

a–c, mapas de calor para la cobertura de ARN 5′P específica de aminoácido con código de color azul (bajo) a amarillo (alto). La distancia de los aminoácidos específicos se indica como el número de nucleótidos. Los ribosomas detenidos en -14 indican un estancamiento en el sitio A. Los aminoácidos seleccionados también se muestran como gráficos de líneas. a, L. plantarum hace una pausa después del tratamiento CAM (amarillo) y MUP (púrpura) en comparación con la muestra de control NT recolectada en OD600 = 0.6–0.8 (OD = 0.6). b, pausas de CAM específicas del contexto de B. subtilis inducidas por el penúltimo aminoácido (de la cadena peptídica) que se muestran en la posición -8 (CAM, amarillo). c, L. plantarum hace una pausa después del tratamiento de estrés. d, e, PCA del fenotipo de protección de ribosomas (Métodos) distingue entre estrés y tratamiento farmacológico en L. plantarum (d) y B. subtilis (e). Los grupos separados de B. subtilis sin tratar pueden explicarse por las diferencias en su fase de crecimiento en el momento de la cosecha (OD600 0,2–0,3 y 0,6–0,8, respectivamente).

A continuación, estudiamos los perfiles de degradación del ARN 5′P en condiciones de estrés en B. subtillis, L. plantarum y L. reuteri (Fig. 2c y Extended Data Fig. 4). Identificamos pausas claras en los ribosomas en L. plantarum en los codones Tyr en condiciones de choque térmico y bajo contenido de nutrientes (LNUT), y en los codones His y Arg en crecimiento estacionario (STAT; Fig. 2c). 5P-seq proporciona una descripción general de la acumulación dependiente de ribosomas de los intermedios de degradación de 5′P en todas las posiciones de aminoácidos, y utilizamos estos datos para generar un 'fenotipo de protección de ribosomas' específico de aminoácido general para cada muestra (Métodos). La combinación de este fenotipo con el análisis de componentes principales (PCA) nos permitió separar muestras de control, estresadas y tratadas con fármacos en L. plantarum (Fig. 2d). De manera similar, la misma estrategia separa el tratamiento farmacológico, las condiciones de estrés y la medición del curso temporal de la fase estacionaria en B. subtilis (24 h, 48 hy 8 d) (Fig. 2e). Por lo tanto, los fenotipos de protección de ribosomas específicos de codón se pueden aprovechar para distinguir el tratamiento farmacológico y otras condiciones de estrés. Para analizar las paradas de ribosomas específicas de codón en respuesta a los cambios ambientales, nos enfocamos en las lecturas de 5′P asociadas con las paradas del sitio A del ribosoma (Datos extendidos Fig. 4c, d). Después del choque térmico en L. plantarum, encontramos que los codones Gln tienen una mayor cobertura de 5′P, lo que sugiere que los ribosomas se estancan en codones específicos. En el crecimiento estacionario, los codones Arg (CGG, CGA, AGG y AGA, pero menos que CGG y CGU) se asociaron con paradas de ribosomas (Datos extendidos, Fig. 4e). Curiosamente, al aplicar la misma estrategia a B. subtilis. (Datos extendidos Fig. 4d) observamos que el choque térmico también se asoció con paradas de ribosomas en los codones Gln (CAA y CAG) y crecimiento estacionario con paradas en los codones Arg (CGC) (Datos extendidos Fig. 4f). Esto sugiere que los desafíos ambientales pueden dar lugar a estancamientos de ribosomas específicos de codón similares, que pueden deberse a defectos específicos de estrés del procesamiento y biosíntesis del ARNt32,33 o cambios en las reservas de aminoácidos29,34,35.

Además de los patrones globales, 5PSeq también proporciona información sobre las paradas de ribosomas específicas de genes. Medimos la fuerza relativa de los patrones de protección de 3 nt en los genes (índice de protección del marco específico del gen (FPI); Métodos). Esto proporciona una medida del estancamiento relativo del último ribosoma de traducción independiente de la abundancia de mRNA para cada gen (es decir, comparando picos y valles a lo largo de la secuencia de mRNA). Los tratamientos farmacológicos y de estrés inducen cambios en el FPI de genes individuales involucrados en las respuestas bacterianas (Datos extendidos Fig. 5 y Tabla complementaria 3). Por ejemplo, el choque térmico conduce a un aumento de FPI (mayor periodicidad de 3 nt) para los ARNm asociados con la pared de la espora (tasa de descubrimiento falso (FDR) < 0,022) y también estrés salino, con actividad de oxidorreductasa (FDR < 0,011). Durante el crecimiento estacionario, el FPI de los genes relacionados con la pared de la espora aumentó (FDR < 2,2 × 10–16), mientras que el de los genes implicados en la biosíntesis de Lys y el procesamiento del ARN ribosómico disminuyó (FDR < 0,024 y < 0,044, respectivamente). Curiosamente, cuando se expuso a CAM o MUP, el FPI relativo de los genes de proteínas ribosómicas disminuyó claramente (FDR < 2,2 × 10–16), lo que sugiere un cambio relativo en la protección del ribosoma con respecto al resto del transcriptoma en respuesta a los fármacos. Estos hallazgos demuestran que 5P-seq puede informar sobre la posición de los ribosomas y la regulación de la traducción durante el estrés también a nivel de genes específicos, y detectar respuestas traduccionales fenotípicas rápidas al tratamiento farmacológico.

La cuantificación de la abundancia relativa de intermediarios de degradación de ARNm se puede realizar usando 5PSeq. Investigamos cómo se alteró globalmente el degradoma en múltiples especies usando diferentes perturbaciones. Primero, investigamos la abundancia en todo el genoma de las moléculas de ARN 5′P (Datos extendidos Fig. 6a). La distribución del ARN 5'P en el cromosoma de B. subtilis fue relativamente estable para todos los mutantes de ARNasa probados, pero observamos un aumento en los ARN que se originan en las regiones intragénicas después del choque térmico. En E. coli observamos diferencias entre cepas, con moléculas de ARN 5′P asociadas preferentemente con la región codificante en DH5α y con regiones no traducidas (UTR) 5′ en MG1655, de acuerdo con las diferencias observadas en el ARN 5′P alrededor de las regiones codificantes (Datos ampliados Fig. 2). También observamos un aumento del ARN 5'P de las regiones intergénicas en E. coli. A continuación, investigamos la variación en los intermedios de degradación de 5′P a nivel de un solo gen, una medida que integra la abundancia de cada ARN maduro con la probabilidad de descomposición (Datos extendidos Fig. 6 y Tabla complementaria 3). Cuantificamos la abundancia específica de genes de los fragmentos de ARNm de 5′P en B. subtilis y demostramos que el choque térmico aumentó los intermedios de degradación de los genes de germinación de esporas (FDR < 7,68 × 10–4), el estrés salino y la biosíntesis de His (FDR < 2,2 × 10 -dieciséis). El crecimiento estacionario condujo a una disminución en los fragmentos de ARNm de 5′P asociados con la traducción tanto en B. subtilis como en L. plantarum (FDR < 2,2 × 10–16). En E. coli, el choque térmico provocó una disminución de los intermediarios de degradación asociados con la traducción (FDR < 2,2 × 10–16) y un aumento de los asociados con el catabolismo de la glucosa (FDR < 0,016). A continuación, examinamos cómo las RNasas específicas en B. subtilis afectan la abundancia de fragmentos de degradoma de ARNm 5'P específicos de genes. De acuerdo con nuestro análisis de metagen, la eliminación de rnjA se separó de la cepa de tipo salvaje y los mutantes de eliminación de rnjB y rnY en un PCA de abundancia específica de genes de intermediarios de degradación de ARNm (Datos extendidos Fig. 6b y Tabla complementaria 4). También observamos una disminución en los intermedios de degradación asociados con la traducción (FDR <2.2 × 10–16) (Tabla complementaria 3). La eliminación de rnjB condujo a una disminución en los intermediarios de degradación asociados con el sistema de fosfotransferasa de azúcar dependiente de fosfoenolpiruvato (FDR < 2,2 × 10–16) y la eliminación de rny condujo a una disminución en los intermediarios de degradación asociados con la quimiotaxis (FDR < 2,2 × 10–16).

Para caracterizar las funciones reguladoras de las RNasas, investigamos el efecto de su agotamiento en la abundancia de ARN reguladores y UTR 5 '(Datos extendidos Fig. 6c, d y Tabla complementaria 4). La eliminación de rnjA condujo a un aumento en la histidil-tRNA sintetasa 5 'UTR (FDR < 8.86 × 10–7), el riboswitch de caja T específico de Ser tRNA ligase (FDR < 3.18 × 10–7) y el pequeño ARN regulador roxS ( FDR <7.9 × 10–4) entre muchos otros (consulte los datos extendidos Fig. 6c, d y la Tabla complementaria 4 para obtener detalles y otras RNasas). Curiosamente, además de la cobertura en la región de codificación, también identificamos picos de 5′P que se superponen a los sitios de inicio de la transcripción en B. subtilis y E. coli (Datos extendidos Fig. 6e, f).

Habiendo demostrado que 5PSeq mapea la dinámica de los ribosomas en las bacterias, a continuación lo aplicamos a muestras mixtas. Aunque los microbiomas humanos tienen un papel en la salud y la enfermedad36,37, nuestra comprensión de la regulación postranscripcional del microbioma es limitada. El perfil de ribosomas, basado en el fraccionamiento de polirribosomas seguido de la huella y secuenciación de ribosomas in vitro, se ha utilizado para mapear la posición de los ribosomas19, pero su aplicación al microbioma es técnicamente desafiante38 y está limitada por el pequeño tamaño de los fragmentos de protección de los ribosomas después de la digestión de ARN in vitro (~23 –24 nt)17,39. La secuenciación de degradoma tiene ventajas potenciales, que incluyen (1) fragmentos protegidos por ribosomas generados in vivo más largos, que pueden permitir la resolución de especies estrechamente relacionadas en una muestra (Datos extendidos Fig. 7a); (2) simplicidad, sin necesidad de fraccionamiento subcelular40; (3) ser aplicable a muestras de ARN almacenadas5,41; y (4) proporcionar información sobre la posición de los ribosomas in vivo, las paradas de ribosomas específicas de codones y las limitaciones de aminoácidos en especies que contienen RNasa J, que se estima que representan ~60 % de las especies bacterianas9.

Para demostrar la aplicabilidad de 5PSeq a las comunidades bacterianas, primero analizamos los intermedios de degradación del ARNm de 5'P en una mezcla de dos especies estrechamente relacionadas, L. reuteri y L. plantarum. Agrupamos diferentes cantidades de ARN de L. plantarum tratada con MUP con L. reuteri sin tratar (1: 1–1: 10, 000; Fig. 3a). Las pausas del ribosoma Ile asociadas a MUP se pueden detectar incluso en la proporción de 1:10.000 (0,01 % de abundancia). El límite está determinado por la profundidad de secuenciación (es decir, en la mezcla 1:10 000, solo se asignaron 82 lecturas a secuencias de codificación de L. plantarum). Habiendo confirmado nuestra capacidad para detectar perturbaciones específicas de especies, luego investigamos la dinámica de los ribosomas en estándares definidos de comunidades microbianas (Datos extendidos Fig. 7b). Luego investigamos muestras de microbiomas clínicos y ambientales, estudiando el metadegradoma de los microbiomas vaginales utilizando muestras de ARN previamente aisladas42. Además de la indicación de abundancia de especies basada en ARN, obtuvimos perfiles de degradación para la mayoría de las especies identificadas (Fig. 3b). Estos datos permitieron la investigación de fenotipos de protección de ribosomas in vivo entre especies y pacientes. Finalmente, aplicamos nuestro método a microbiomas más complejos (microbioma fecal humano y compost; datos extendidos Fig. 7c, d).

a, Gráficos lineales que muestran la abundancia del metagen 5P|Seq con respecto a los codones Ile para L. reuteri (azul claro) y L. plantarum (púrpura) mezclados en diferentes proporciones (1:1–1:10 000; L. plantarum versus L.reuteri ). El tratamiento MUP de L. plantarum (abajo) condujo a claras pausas de Ile con respecto al control de L. reuteri NT. L. plantarum y L. reuteri tienen del 63 al 80 % de similitud genómica entre sus regiones codificantes. b, análisis 5PSeq de microbiomas vaginales previamente aislados. Los números de lecturas asignadas a cada especie y donantes sanos se indican mediante círculos. Protección de trama relativa y FFT, así como la presencia/ausencia de RNasas seleccionadas, como en la Fig. 1.

Razonamos que 5P-seq podría ser capaz de detectar respuestas postranscripcionales específicas de la especie a los tratamientos farmacológicos independientemente de los cambios en la abundancia de ARNm. Analizamos el metadegradoma de cultivos de microbiomas fecales complejos ricos en Bacillota y Bacteroidota en respuesta a fármacos dirigidos a la traducción (Fig. 4 y Datos extendidos Fig. 8a). Usamos CAM, MUP, doxiciclina (DOX, inhibición del alargamiento de la traducción) y eritromicina (ERY, interferencia con la translocación de aminoacilo). Primero nos enfocamos en Bacillota (que contiene RNase J) donde la secuenciación del metadegradoma proporciona una resolución más alta. Como se esperaba de nuestros análisis previos en especies aisladas, el uso de CAM y MUP condujo a estancamientos específicos del contexto en Ile y Ala en Bacillota, como en Enterococcus faecalis (clase Bacilli), Clostridium tyrobutiricum (clase Clostridia) y Anaeroglobus geminatus (clase Negativicutes) (Fig. 4a,b). Para DOX, observamos una clara acumulación de ARN 5'P -11 nt desde el codón de inicio, lo que indica que la protección de los ribosomas se detuvo en el nivel de iniciación (Fig. 4c). Para ERY observamos estancamiento de ribosomas asociado con aminoácidos cargados positivamente, incluidos Lys (K) y Arg (R). Esto ocurrió específicamente para los motivos (R/K) × (R/K) (Fig. 4d) y Pro (Datos extendidos Fig. 8b), de acuerdo con informes anteriores43,44,45,46. Los efectos se observaron tan pronto como 5 min después del tratamiento, con efectos máximos después de 30 min (Fig. 4). Esta respuesta tardía es consistente con una tasa de crecimiento más lenta de los cultivos fecales y un retraso en la respuesta de traducción. Curiosamente, cada fármaco tuvo efectos variables sobre las especies bacterianas en los cultivos mixtos, lo que sugiere que el estado fisiológico específico de la bacteria y la composición del cultivo pueden modular la capacidad de las células para responder a la perturbación de la traducción: por ejemplo, Enterococcus faecium46 no respondió a los fármacos en nuestros experimentos. (Datos extendidos Fig. 8c).

a–d, Gráficos de líneas que muestran la abundancia del metagen 5PSeq con respecto a las características seleccionadas. La distancia de los aminoácidos específicos se indica por el número de nucleótidos. Especies de ejemplo de tres clases diferentes—E. faecalis (Bacilli), C. tyrothricin (Clostridia) y A. geminatus (Negativicutes)—del phylum Bacillota se presentan. a, Distribución de los puntos finales 5' en relación con los codones Ile en muestras tratadas con MUP después de 5 y 30 min en comparación con el control NT. b, Como en a pero para los codones Ala después del tratamiento con CAM. c, Como en a pero para los codones de inicio después del tratamiento con DOX. d, como en a pero para el primer codón de motivos tripéptidos enriquecidos con Lys (K) y Arg (R) de la forma (R/K) × (R/K) en muestras tratadas con ERY.

En nuestros experimentos con microbiomas también identificamos diversidad en los mecanismos de estancamiento de los ribosomas de Bacillota. Las especies de las clases Clostridia y Negativicutes, por ejemplo, C. tyrobutiricum y el patógeno oportunista A. geminatus, tienen una firma de protección adicional 2 nt aguas arriba de un estancamiento de ribosomas (Fig. 4). Esto ocurrió con todos los fármacos probados y los ribosomas afectados se estancaron durante la elongación o la iniciación. Además, se conservó en especies relacionadas filogenéticamente, lo que sugiere que los ribosomas estancados en esas especies interactúan con cofactores adicionales, o presentan una conformación alternativa, que altera los patrones de protección de los ribosomas in vivo.

Finalmente, probamos el efecto de los tratamientos con antibióticos en el perfil del metadegradoma de las especies de Bacteroidota y Pseudomonadota que carecen de actividad de exonucleasa 5′–3′. Aunque no esperábamos información de un solo nucleótido sobre el estancamiento diferencial de los ribosomas, los tratamientos con antibióticos llevaron a una acumulación de sitios 5′P alrededor del codón de inicio, como se observó para CAM y ERY en Bacteroides uniformis y Bacteroides fragilis, para DOX en Bacteroides thetaiotaomicron y para MUP y CAM en E. coli (Datos extendidos Fig. 8d). En resumen, hemos demostrado que la secuenciación de metadegradomas puede revelar información específica de especies sobre la regulación postranscripcional en muestras de microbiomas complejos.

Para mostrar la amplitud de usos de nuestro método, compilamos un atlas de descomposición del ARNm en el árbol de la vida bacteriano (Fig. 5). Analizamos 96 especies en 58 géneros (Fig. 5 y Tablas complementarias 5–7), identificando un acuerdo entre los patrones de degradación del ARNm y la clasificación taxonómica y la existencia de una periodicidad de 3 nt en la mayoría de los géneros (Fig. 5, diagrama de barras interno en rojo). Los géneros que contienen RNasa J, como los de Bacillota (en verde), tienen una periodicidad clara de 3 nt con una preferencia general por 5′P en el marco F1 (por ejemplo, spp. Lactobacillus, Bacillus y Megasphaera). Por otro lado, Bacteroidota que son más dependientes de la escisión endonucleolítica, con proteínas de la familia RNasa E y G y RNasa Y, presentan sitios 5′P frecuentemente asociados con el último nucleótido del codón (F2; Fig. 5, color beige) en , por ejemplo, Parabacteroides, Alistipes y Bacteroides. Muchas especies tienen patrones 5'P asociados a codones más complejos. Por ejemplo, Ureaplasma (Mycoplasmatota) y Akkermansia (Verrucomicrobia) tienen sitios 5′P en F1 y F2, mientras que Caulobacter (Pseudomonadota) y Prevotella (Bacteroidota) están asociados con F1 y F0. Es importante tener en cuenta que tanto la preferencia por 5′P como la protección de los ribosomas pueden verse influenciadas por las condiciones ambientales o los tratamientos farmacológicos19, así como por la taxonomía. Algunas especies para las que producimos una cobertura de secuenciación profunda (Fig. 5, círculo gris interior), como E. coli (representante de la clase Gammaproteobacteria), no muestran una clara preferencia por 5′P con respecto a las posiciones de los codones. De acuerdo con nuestro análisis anterior de preferencia de secuencia para sitios 5'P (Fig. 1c), observamos que las especies con RNasa J muestran poca preferencia específica de secuencia 5'P. Las especies más dependientes de la actividad endonucleolítica de la RNasa G suelen utilizar –1 U/+1 A, mientras que las que dependen de la RNasa Y presentan un claro enriquecimiento de +1 A. Para profundizar en la interacción entre la maquinaria de degradación del ARN y la posición del ribosoma, investigamos la protección de los ribosomas estancados en los codones Ile después del tratamiento con MUP (círculo púrpura exterior, Fig. 5). Centrándonos en Bacillota, además del tamaño de protección esperado (es decir, 14 nt, como en la Fig. 2), observamos protecciones a -16 nt en el género Clostridia, lo que indica mecanismos divergentes en respuesta a ribosomas estancados en especies filogenéticamente relacionadas. Estos resultados muestran que la investigación global de la degradación del ARNm in vivo, combinada con la perturbación de la traducción, es una herramienta útil en el descubrimiento de mecanismos actualmente no caracterizados para la regulación de la traducción y la respuesta específica de la especie a los tratamientos con antibióticos.

Árbol taxonómico de las especies investigadas. Círculos, de adentro hacia afuera, gris (número de lecturas asignadas); rojo (intensidad de periodicidad de 3 nt), preferencia de cuadro (F0, beige; F1, verde; F2, azul claro); identificación de enzimas seleccionadas involucradas en la degradación del ARN a nivel de género RNJA, RNY y RNE/G; ribonucleasas de la familia de proteínas E/G; acumulación de puntos finales 5′P 13–17 nt antes de los codones Ile después de 30 min de tratamiento con MUP; motivos de escisión 4 nt alrededor de los puntos finales 5′P de especies seleccionadas (omitiendo Bacillota sin preferencia de escisión (Fig. 1c)). En general, 58 géneros estuvieron presentes en muestras de bacterias cultivadas y entornos complejos, incluidos hisopos vaginales, heces, cultivos fecales y compost. En muestras complejas, se consideraron especies con al menos 1000 lecturas en las regiones de codificación (300 en el caso del compost) y se analizaron los géneros respectivos (Métodos).

Para facilitar el uso de nuestro recurso que investiga la interacción entre las RNasas y el proceso de traducción entre las bacterias, proporcionamos un sitio web navegable interactivo para una mayor exploración (http://metadegradome.pelechanolab.com).

Investigamos los intermedios de degradación del ARNm en especies aisladas y microbiomas complejos utilizando un método 5PSeq optimizado y descubrimos que la degradación del ARNm cotraduccional está muy extendida entre las bacterias. En las especies que contienen RNasa J, los intermediarios de desintegración de ARNm de 5′P proporcionaron información de protección de ribosomas con una resolución de un solo nucleótido. Nuestro enfoque permite el estudio de paradas de ribosomas específicas de genes y codones in vivo sin necesidad de tratamiento farmacológico, fraccionamiento subcelular o degradación del ARN in vitro. Mostramos que 5PSeq optimizado puede detectar la regulación traduccional desencadenada por el medio ambiente en múltiples especies, tanto en el codón (Fig. 2) como en el nivel específico del gen (Tabla complementaria 3). En especies sin actividad de exonucleasa 5'–3', la perturbación del proceso de traducción resultó en alteraciones de la distribución de 5'P a lo largo de los genes. Esto sugiere que, a pesar de carecer de una exonucleasa 5'–3' capaz de imprimir la posición del ribosoma con una resolución de un solo nucleótido, los cambios en la posición del ribosoma también dan forma al degradoma de ARNm cotraduccional en esas especies. Explotamos los procesos de descomposición cotraduccional en bacterias para demostrar que 5PSeq puede detectar respuestas postranscripcionales rápidas (dentro de 5 minutos) a las perturbaciones del proceso traduccional por tratamiento farmacológico, independientemente de los cambios en la abundancia de ARNm. Debido a que la descomposición del ARNm cotraduccional es frecuente pero distintiva entre las especies bacterianas, se puede aplicar una firma 5PSeq para capturar respuestas postranscripcionales específicas de la especie a las perturbaciones. Proponemos que la adopción de nuestro método permita potencialmente el estudio de la regulación ambiental o química de la traducción sin la necesidad de cultivo o fraccionamiento subcelular. Usando nuestro método optimizado, mostramos que la posición de los ribosomas es clave para dar forma a los límites y la abundancia de los degradomas bacterianos. Mostramos que los cambios ambientales que conducen a defectos específicos del estrés en la biosíntesis o el procesamiento del ARNt32, o cambios en la disponibilidad de aminoácidos47, alteran el degradado de una manera predecible en especies que contienen RNasa J. Además, nuestro trabajo sugiere que la respuesta estricta bacteriana, además de controlar transcripción y traducción35,48, también altera el degradoma bacteriano. También mostramos que las paradas de ribosomas y los patrones de descomposición cotraduccionales asociados están altamente regulados en condiciones de estrés y pueden usarse para investigar alteraciones específicas de genes independientemente de los cambios en la abundancia de ARNm. Por ejemplo, observamos cambios claros en la periodicidad de 3 nt (FPI) específica de genes para genes asociados con la traducción y la formación de paredes de esporas en B. subtilis (Datos extendidos Fig. 5). Al diseccionar la contribución de diferentes RNasas al degradoma en B. subtilis, también identificamos la regulación específica del gen de los 5 'UTR reguladores y los ARN reguladores pequeños (Tabla complementaria 4), así como su interacción con los ribointerruptores bacterianos49. Esta información será útil para la futura disección de elementos reguladores en los líderes de ARNm y para facilitar la disección molecular de su mecanismo de acción. Es importante destacar que el análisis de metadegradoma realizado en este manuscrito es directamente aplicable a una amplia variedad de especies cultivables y no cultivables donde la abundancia de RNasa se puede inferir fácilmente (Tabla complementaria 6), allanando así el camino para la disección molecular de la descomposición del ARN en bacterias no modelo. especies.

Finalmente, mostramos que 5PSeq se puede aplicar ampliamente a microbiomas clínicos y ambientales complejos para obtener perfiles de metadegradomas específicos de especies. Al eliminar la necesidad de protocolos experimentales complejos y cultivos bacterianos, los investigadores podrán analizar fenotipos de protección de ribosomas en especies bacterianas no cultivables, que se estima que comprenden más de la mitad de las comunidades bacterianas humanas50. Nuestro enfoque puede detectar respuestas traslacionales incluso en especies presentes con una abundancia del 0,01 % en una comunidad bacteriana y, mediante el uso de las huellas de los ribosomas más largas, permite el análisis de comunidades bacterianas complejas con una resolución de una sola especie. Para demostrar su utilidad y capacidad para complementar los enfoques metagenómicos actuales, caracterizamos la dinámica de los ribosomas en cultivos fecales complejos después del tratamiento con antibióticos. Nuestro trabajo muestra que 5PSeq puede identificar fácilmente respuestas postranscripcionales rápidas a antibióticos dirigidos al proceso de traducción. Esto confirma nuestra capacidad para investigar cambios específicos de codones en muestras microbianas complejas y allana el camino para el uso de firmas de degradoma como indicadores moleculares para respuestas específicas de especies a fármacos. Proporcionamos un atlas de la degradación del ARNm bacteriano para 96 ​​especies que abarcan 58 géneros. Nuestros resultados resaltan la diversidad de la maquinaria de degradación del ARNm en los procariotas y demuestran la utilidad de combinar la perturbación de la traducción y el degradado del ARNm 5'P. Esperamos que, al combinar la secuenciación del ARN 5′P (Tabla complementaria 4) con una medida de las RNasas expresadas (Tabla complementaria 7), en el futuro el estudio del metadegradoma facilitará la caracterización mecánica de los líderes reguladores 5' en menos especies bien caracterizadas.

En resumen, nuestro análisis de la degradación del ARNm en el árbol de la vida bacteriano revela cómo el metadegradoma proporciona información valiosa sobre la fisiología específica de la especie, incluidas las respuestas a los medicamentos, la disponibilidad de aminoácidos intracelulares y las respuestas ambientales. Los análisis de metadegradomas permitirán la caracterización de la regulación postranscripcional en los microbiomas y arrojarán luz sobre la biología de las comunidades microbianas.

Se usaron cultivos bacterianos durante la noche (sin exceder la densidad óptica 1 (OD600 = 1) para diluir el cultivo principal a una OD600 inicial de 0,03–0,05. Los cultivos se recolectaron por centrifugación al alcanzar la fase logarítmica (OD600 = 0,4–0,8) a menos que se indique lo contrario. Si no se indica lo contrario, los cultivos bacterianos se cultivaron a 37 °C con rotación utilizando los medios de crecimiento recomendados. Específicamente, L. plantarum (ATCC 8014) y L. reuteri (DSM 17938) se cultivaron en caldo MRS (Sigma-Aldrich). L Los tratamientos de estrés plantarum se llevaron a cabo de la siguiente manera: los cultivos en fase estacionaria se cultivaron durante 27 h después de la inoculación y se cosecharon a una DO600 = ~ 4,5 Para generar muestras para el control no tratado, el choque térmico y cultivos replicados biológicos bajos en nutrientes (40 ml) se cultivaron hasta la fase logarítmica media (OD600 = 0,3–0,6), se dividieron (10 ml para el control sin tratar, 15 ml para el choque térmico y 15 ml para la muestra con bajo contenido de nutrientes) y las células se recolectaron mediante centrifugación. inmediatamente para el análisis de ARN. Antes del choque térmico, las células se resuspendieron en caldo MRS precalentado y se incubaron en un termomezclador durante 15 min a 60 °C. Los sedimentos de células con bajo contenido de nutrientes se lavaron minuciosamente con 50 ml de medio LB 0,5x (Sigma), se centrifugaron y el sobrenadante se eliminó por completo. Luego, las células se resuspendieron en medio LB 0,5 × precalentado (Sigma) y se recolectaron después de un tiempo de incubación total de 15 min a 37 ° CB. 1 % (p/v) de extracto de levadura (Bacto) y 0,5 % (p/v) de NaCl. Para un crecimiento prolongado, recolectamos muestras a mitad de logaritmo, 24 h, 48 h y 8 días después de la inoculación. El estrés salino se realizó mezclando volúmenes iguales de NaCl 2 M con B. subtilis cultivada en fase logarítmica media (OD600 = 0,5–0,6), seguido de 10 min de incubación a temperatura ambiente y recolección por centrifugación Cultivos biológicos replicados de L. plantarum, L. reuteri, E. coli (Invitrogen, n.º 18265-017) y B. amyloliquefaciens se cultivaron en medio LB hasta la fase logarítmica, luego los cultivos se dividieron para generar muestras para el control sin tratar y el control fragmentado al azar. Cultivos de L. plantarum y L. reuteri cultivados a una concentración final de 100 µg ml–1, incubados durante 5 min a 37 °C y posteriormente recolectados en hielo que contenía 100 µg ml–1 adicionales de CAM5. El tratamiento con MUP (concentración final de 65 µg ml–1) de L. plantarum y L. reuteri de registro medio se llevó a cabo durante 10 min a 37 °C después de la centrifugación y la congelación instantánea del sedimento. C. crescentus (cepa NA1000) se cultivó en medio PYE que contenía 0,2 % (peso/vol) de peptona (Bacto) y 0,1 % de extracto de levadura (Bacto) a 30 °C hasta la mitad del registro, seguido de centrifugación y congelación rápida de los sedimento celular. La cepa de Synechocystis PCC6083 se cultivó en medio de crecimiento BG11 a 30 °C a una intensidad de luz de 30 µE y 1 % de CO2 atmosférico y se recolectó en la fase logarítmica media51. Los tratamientos de choque térmico para las cepas de E. coli, B. subtilis de tipo salvaje y RNase knockout se llevaron a cabo de la siguiente manera: la cepa de E. coli (MG1655) se cultivó en medio LB a 37 °C hasta la fase logarítmica tardía (0,6–0,8); Las cepas de B. subtilis de tipo salvaje (168trpC2), rnjA, rnjB y deleción rny41,52 se cultivaron a 37 °C en LB (suplementado con 100 µg ml–1 de espectinomicina para rnjA y 5 µg ml–1 de kanamicina para rnjB y deleción rny cepas) a la fase de crecimiento logarítmico (0,2–0,3). El cultivo se dividió en dos, el sedimento celular se recogió por centrifugación y la muestra de control no tratada se congeló inmediatamente. El choque térmico se llevó a cabo resuspendiendo las células en medio LB precalentado a 65 °C seguido de 10 min de incubación a 65 °C. Las muestras se recogieron por centrifugación y se congelaron rápidamente en un baño de etanol/hielo seco para el análisis de ARN.

Para el tratamiento antibiótico de E. coli, la cepa MG1655 se cultivó en LB a 37 °C hasta la fase exponencial y los cultivos se dividieron en tres para el muestreo del control no tratado, MUP (65 µg ml–1) y CAM (100 µg ml–1). Los cultivos se incubaron con antibióticos durante 10 min a 37 °C, se recolectaron por centrifugación y se congelaron en un baño de etanol/hielo seco para el análisis de ARN.

Para la expresión de RNasa J en E. coli, las diez células principales se transformaron con plásmido que contenía la secuencia codificante de RNasa JA de S. pyogenes (plásmido pEC622:pEC85 con promotor rnjA + rnjA (que expresa RNasa J1 para complementación en S. pyogenes (pEC85 replicas en E. coli), un regalo de E. Charpentier). Las cepas A. finegoldii (DSM 17242), P. copri (DSM 18205), P. merdae (DSM 19495) y P. timonesis (DSM 22865) fueron cultivadas anaeróbicamente en caldo GAM (HyServe) durante 24 h. Cuando se indique, las especies se trataron con MUP (65 µg ml–1) o CAM (100 µg ml–1) durante 10 min. Después de la incubación, se extrajeron alícuotas de 1 ml y las células se sometieron catalíticamente inactivado por la adición de RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) y recogido por centrifugación.

Para monitorear los efectos de las drogas en la dinámica del metadegradoma, examinamos dos microbiomas intestinales humanos cultivados anaeróbicamente contra cuatro drogas a lo largo del tiempo. Se recolectaron microbiomas intestinales de pacientes sanos y se resuspendieron en glicerol al 40 % y se almacenaron alícuotas de 500 µl a –80 °C. Se utilizó una alícuota para inocular 10 ml de cultivo iniciador mantenido en caldo MCDA durante 24 h53 en ausencia de oxígeno y en presencia de 2,5–3,0 % de hidrógeno a 37 °C. Para asegurar que la comunidad microbiana se encontraba en una fase de crecimiento metabólicamente activa, diluimos los cultivos iniciadores con medio MCDA fresco en una proporción de 1:10 24 h antes de comenzar el experimento, en un volumen total de 30 ml, en las condiciones anaeróbicas indicadas anteriormente. pero sin temblar. Para el tratamiento con antibióticos, se transfirieron 6 ml de cultivo fecal a un tubo Falcon de 15 ml sin antibióticos o complementado con CAM (80 µg ml–1), MUP (650 µg ml–1), DOX (5 µg ml–1) o ERY (5 µg ml–1). Después de la incubación durante 5 min, 30 min o 48 h, se extrajeron alícuotas de 1 ml y las células en crecimiento se inactivaron catalíticamente mediante la adición de RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) (t0 antes del tratamiento y a los 5 min, 30 min y 48 h después del tratamiento) y cosechado por centrifugación. El número de réplicas para cada muestra se enumera en la Tabla complementaria 2.

La extracción de ARN (si no se indica lo contrario) se realizó como se describe en la ref. 54, con modificaciones menores. En resumen, los sedimentos celulares se resuspendieron en volúmenes iguales de LET (Tris 25 mM, pH 8,0, LiCl 100 mM, EDTA 20 mM) y fenol saturado con agua, pH 6,6 (Thermo Fisher). Las células se lisaron con perlas de vidrio lavadas con ácido (Sigma-Aldrich) mediante agitación vorticial durante 3 min en MultiMixer. Después de la adición de volúmenes iguales de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico pH 4,5 (25:24:1) y agua libre de nucleasas, la lisis se prolongó durante 2 minutos adicionales de agitación vorticial seguida de centrifugación. La fase acuosa resultante se purificó en dos pasos usando fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) seguido de cloroformo. Después de la centrifugación, la fase acuosa limpia se precipitó con acetato de sodio-etanol. Para las mezclas de Lactobacillus (Fig. 3a), el ARN microbiano extraído de L. plantarum (control no tratado y tratado con MUP) se mezcló antes del paso de ligadura de ARN del protocolo de la biblioteca 5P-seq en diferentes proporciones con el ARN extraído de L. reuteri (no tratado) . Se generaron réplicas técnicas del Microbial Community Standard (Zymobiomics, n.º D6300, lote n.º ZRC 190633), que constan de ocho cepas bacterianas desactivadas, mediante la extracción de ARN de 75 a 125 µl de suspensión de células descongeladas. Las muestras de torunda vaginal se lisaron mecánicamente utilizando perlas en 1000 µl de protector de ADN/ARN (ZymoResearch) y el lisado se almacenó a –80 °C durante 2 meses antes de su uso. El lisado se descongeló y se usaron 250 µl para extraer el ARN microbiano. Se recolectaron heces de un donante sano y se transportaron en glicerol al 40%. Se extrajeron réplicas técnicas de ARN el día indicado anteriormente, con modificaciones menores enumeradas a continuación. En resumen, se mezclaron 500 µl de heces/suspensión de glicerol con un volumen igual de tampón LET que contenía SDS (Tris 25 mM pH 8,0, LiCl 100 mM, EDTA 20 mM, SDS al 10 %) y fenol saturado con agua pH 6,6 (Thermo Fisher ). La lisis se realizó agitando en vórtex con perlas de carburo; la duración se extendió a 10 min después de la adición de volúmenes iguales de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico pH 4,5 (25:24:1) y agua libre de nucleasas. Todos los pasos posteriores se realizaron como se describe anteriormente. El ARN del experimento de evolución temporal del microbioma intestinal cultivado se extrajo como se indica, con modificaciones en el tampón LET que contenía SDS (Tris 25 mM, pH 8,0, LiCl 100 mM, EDTA 20 mM, SDS al 10 %). El ARN del compost se extrajo con 2 g de material de partida (de Sundbyberg, Suecia) usando el kit de ARN total RNeasy PowerSoil (Qiagen) como se recomienda en las pautas del fabricante. La calidad del ARN se evaluó cargando 1 µg de ARN total en gel de agarosa al 1,2 % o 12 ng de ARN total en un BioAnalyzer usando un chip RNA Nano 6000 (Agilent Technologies). Antes de la preparación de la biblioteca 5P-seq, el ARN se cuantificó con el kit Qubit RNA BR (Broad-Range) (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las pautas del fabricante.

La purificación del ADN se llevó a cabo mediante la lisis de células de la comunidad microbiana intestinal con perlas de vidrio (Sigma), combinada con extracción con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y precipitación con etanol. El protocolo de flujo de trabajo fue idéntico al procedimiento de extracción de ARN descrito anteriormente, pero con la sustitución de LET (25 mM Tris pH 8,0, 100 mM LiCl, 20 mM EDTA, 10 % SDS) con 10 mM Tris-HCl pH 8,0 y la sustitución de fenol /cloroformo/alcohol isoamílico pH 4,5 con UltraPure fenol/cloroformo/alcohol isoamílico pH 8,0 (Invitrogen)

El fraccionamiento del polirribosoma se realizó como se describió previamente55, con modificaciones menores. En resumen, B. subtilis (168trpC2) se cultivó en medio LB a fase logarítmica media a 37 °C y se cosechó en hielo que contenía 100 µg ml–1 CAM, con centrifugación de 5 min. El precipitado resultante se lisó en 1 × TN (Tris/HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, CAM 100 μg ml–1 y una tableta completa de inhibidor de proteasa libre de EDTA) utilizando perlas de vidrio con agitación vorticial durante 2 min. , seguido de 5 min de incubación en hielo. La lisis y la incubación se repitieron dos veces. Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 1500 g durante 5 min a 4 °C y el sobrenadante se cargó en un gradiente de sacarosa del 15 al 50 % con un colchón del 80 %. Después de la ultracentrifugación a 36 000 rpm durante 90 min, se controló y fraccionó Abs254. Posteriormente, se extrajo el ARN de las fracciones de sacarosa mediante la adición de volúmenes iguales de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico pH 4,5 (25:24:1) y agua libre de nucleasas, seguido de 2 min de agitación vorticial y centrifugación. La fase acuosa se limpió adicionalmente mediante la adición de cloroformo, agitación vorticial y centrifugación y la fase acuosa resultante se precipitó con acetato de sodio/etanol.

Nuestras bibliotecas 5P-seq se prepararon como se describió anteriormente5,41, con modificaciones menores, utilizando 150–9000 ng de ARN total como entrada. Para preparar muestras fragmentadas al azar (controles negativos), el ARN ribosómico se agotó del ARN libre de ADN y la fragmentación posterior mediante incubación durante 5 min a 80 °C en tampón de fragmentación (acetato de Tris 40 mM, pH 8,1, KOAc 100 mM, MgOAc 30 mM) . La reacción se purificó usando dos volúmenes de perlas RNACleanXP (Beckman Coulter) según lo recomendado por el fabricante. Los sitios 5' OH libres se volvieron a fosforilar utilizando 5 U de polinucleótido quinasa T4 (NEB) y se incubaron a 37 °C durante 60 min, según lo recomendado por el fabricante. El ARN fragmentado refosforilado se purificó usando fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (24:25:1) seguido de precipitación con acetato de sodio/etanol. A partir de este paso adelante, se fusionaron los procedimientos para la preparación de bibliotecas 5P-seq estándar y fragmentadas al azar41. El ARN se ligó al oligo rP5_RND o rP5_RNA (Tabla complementaria 1) que contiene identificadores moleculares únicos. El ARN ribosómico se agotó utilizando el kit de eliminación de ARNr Ribozero (Illumina), que es adecuado para bacterias, levaduras y muestras humanas. La muestra empobrecida en ARNr se purificó utilizando 1,8 volúmenes de perlas Ampure (Abcam) y se fragmentó por calor (80 °C) durante 5 min en tampón de fragmentación 5x (acetato de Tris 200 mM, pH 8,1, KOAc 500 mM, MgOAc 150 mM). Las muestras posteriores se transcribieron inversamente utilizando hexámeros aleatorios para cebado. El ADN complementario resultante se unió a perlas de estreptavidina (M-280), se sometió a reacciones enzimáticas de reparación de extremos de ADN y relleno de adenina en los extremos 5' que sobresalen de fragmentos de ADN utilizando Fragmentos de Klenow (NEB). El adaptador común (P7-MPX) se ligó y las bibliotecas 5P-seq se amplificaron mediante PCR (15–17 ciclos), se purificaron con 1,8 volúmenes de perlas Ampure (Abcam) y se cuantificaron con Qubit (Thermo Fisher). El tamaño de la biblioteca se estimó a partir de las trazas del bioanalizador. Las bibliotecas de 5P-seq se agruparon mezclando cantidades iguales de cada muestra, seguido de un enriquecimiento de fragmentos de 300 a 500 nt.

Durante el trabajo descrito en este manuscrito, nuestro laboratorio desarrolló una estrategia simplificada de 5P-seq de alto rendimiento que se aplicó a un subconjunto de muestras, como se detalla en la Tabla complementaria 2. Las bibliotecas compiladas por esta estrategia se generaron como se describió recientemente15,56. En resumen, el ARN libre de ADN se ligó con oligos de ARN que contenían identificadores moleculares únicos. El ARN ligado se transcribió inversamente cebando con oligos que contenían un hexámero aleatorio y una región compatible con Illumina. El ARN se eliminó mediante la adición de NaOH. El ARN ribosómico se agotó mediante la adición de mezclas internas de agotamiento de oligo de ADN de ARNr (Tabla complementaria 1) al ADNc y realizando un tratamiento con nucleasa específica de dúplex (DSN, Evrogen). El ADNc empobrecido en ARNr se amplificó mediante PCR (15–17 ciclos). El agotamiento del ARNr con Ribozero Illumina (para bacterias y levaduras) se realizó después del paso de ligadura del ARN monocatenario. El ARN empobrecido en ribosomas se purificó y se transcribió inversamente usando los oligos mencionados anteriormente y luego se amplificó por PCR. Las bibliotecas se cuantificaron mediante fluorescencia (Qubit, Thermo Fisher), se estimó su tamaño con un bioanalizador Agilent y se secuenciaron con un secuenciador NextSeq500 o NextSeq2000 Illumina.

Las bibliotecas de ADN se prepararon a partir de puntos de tiempo de cultivos fecales tratados sin tratar (t0) y 48 h (t48h) de acuerdo con las pautas del fabricante (ThruPlex DNA-Seq Kit, Takara Bio). En resumen, el ADN se cortó usando un ultrasonicador enfocado ME220 (Covaris) a un tamaño promedio de 350 nt (microtubo AFA Fiber Crimp-Cap, PN 520053). Se usó ADN cortado (30 ng) para implementar una reacción de reparación del extremo del ADN, seguida de la síntesis de la biblioteca y la amplificación por PCR (diez ciclos) con los cebadores NEBi5 y PE2. Las bibliotecas de ADN se purificaron con Ampure XP, se cuantificaron por fluorescencia (Qubit, Thermo Fisher) y se secuenciaron con un secuenciador NextSeq2000 Illumina.

La demultiplexación y la generación fastq de archivos de imagen bcl de secuenciación se realizaron utilizando bcl2fastq (v.2) con opciones predeterminadas. El recorte de adaptador y calidad se realizó con el programa bbduk de la suite BBTools (https://sourceforge.net/projects/bbmap/), con opciones (qtrim=r, ktrim=r, hdist=3, hdist2=2, K= 20, mink=14, trimq=16, minlen=30, maq=16), utilizando el conjunto de adaptadores predeterminados de BBTools y secuencias poliG o poliA para lecturas cortas. Para reducir el tiempo computacional, las lecturas con identificador molecular único (UMI) idéntico y la secuencia de inserción se deduplicaron antes de mapear utilizando el programa de deduplicación de la suite BBTools con parámetros predeterminados. Las secuencias UMI que se encuentran en las primeras ocho bases de cada lectura se extrajeron utilizando herramientas UMI (v.1) con opciones predeterminadas (usando --bc-pattern NNNNNNNN).

Los genomas bacterianos se descargaron el 21 de marzo de 2019 de la base de datos del National Center for Biotechnology Information Assembly (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/) con los siguientes términos de búsqueda: "bacteria"[Filter] AND (latest [filtro] Y ("genoma representativo"[filtro] O "genoma de referencia"[filtro]) Y (todo[filtro] NO "derivado del proyecto de vigilancia"[filtro] Y todo[filtro] NO anómalo[filtro])). La lista se filtró aún más para incluir solo una cepa por especie, dando prioridad a los genomas marcados como "referencia". Los 5804 genomas resultantes (Tabla complementaria 4) se utilizaron para construir el índice de referencia. El índice fue construido con el programa bbmap de la suite BBTools, con opciones por defecto (y k = 10). Además del índice de referencia que contiene los 5.804 genomas bacterianos, se construyeron índices separados para especies cultivadas individualmente y grupos a nivel de género. Los genomas de estos últimos grupos se eligieron del conjunto inicial de 5.804 genomas. El alineamiento se realizó con el programa bbmap de la suite BBTools, con los parámetros (32 bit=t -da -eoom k = 11 strictmaxindel=10 intronlen=0 t = 16 trd=t minid=0.94 nzo=t). Los archivos de alineación se clasificaron e indexaron con SAMtools57. Luego se realizó la deduplicación basada en UMI con UMI-tools (v.1)58, con las opciones (--soft-clip-threshold 1 --edit-distance 2 --method unique). Luego, los archivos BAM se procesaron para enumerar el número de lecturas por especie. Utilizamos un diccionario prealmacenado de nombres de cromosomas y especies y un script personalizado para realizar recuentos en cada especie. La distribución de recuentos entre genes que codifican rRNA, tRNA, mRNA y otros tipos de RNA se calculó con bedtools (https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/). Se usaron recuentos en genes codificadores de ARNm para seleccionar las especies principales en muestras complejas, como se describe a continuación.

Las especies cultivadas individualmente se asignaron directamente a sus índices de referencia. Todas las mezclas de Zymobiomics y las muestras de microbiomas vaginales, fecales y de compost se alinearon con el índice de referencia bacteriano que incluía las 5804 especies. Elegimos especies con al menos 1000 lecturas en las regiones de codificación en todas las muestras excepto en el compost, donde relajamos la selección a 300 lecturas porque había menos especies con recuentos altos. En total, se identificaron 83 especies bacterianas con cobertura específica pertenecientes a 46 géneros de todas las muestras. Se construyeron índices de referencia para estos 46 géneros (las especies se eligieron de la lista preseleccionada de 5804), y todas las muestras complejas de heces y compost se alinearon por separado con esas referencias.

Los archivos de alineación deduplicados, junto con la secuencia del genoma y los archivos de anotación, se proporcionaron como entrada a nuestro paquete fivepseq14 desarrollado recientemente para el análisis y la visualización de la distribución de lecturas del punto final de 5' con las opciones predeterminadas aplicadas. Fivepseq proporciona información sobre la presencia de periodicidad de 3 nt (FFT), la distribución de recuentos de 5' en relación con el inicio/detención de CDS o con los nucleótidos dentro de cada codón (marcos de traducción) y los patrones de protección específicos de codón y aminoácido. Debido a que fivepseq analiza solo un genoma por ejecución, los archivos de alineación para muestras complejas se usaron como entrada para fivepseq para cada genoma por separado. Para el análisis a nivel de género, los archivos de secuencia y anotación para especies individuales se concatenaron en uno solo. Finalmente compilamos un recurso en línea con navegación interactiva de informes producidos a partir de bacterias sin tratar con alta cobertura, en http://metadegradome.pelechanolab.com.

Para generar un fenotipo de protección de ribosomas, tomamos la suma de los recuentos colocados de 30 a 1 nt aguas arriba de cada aminoácido y concatenamos los recuentos escalados por aminoácido para obtener un vector que describe la protección de los ribosomas en cada muestra. Estos vectores se usaron como entrada para PCA realizado con la función prcomp de las estadísticas del paquete R (v.3.6.1). Los gráficos PCA se generaron con el paquete autoplotly (v.0.1.2) en R.

Las anotaciones de Bacillus subtilis para los sitios de inicio transcripcional (TSS) y UTR se obtuvieron de BSGatlas59. Las anotaciones de E. coli para TSS y UTR se obtuvieron de RegulonDB60. Las lecturas de 5′P se asignaron a un TSS determinado si se superponían con ese TSS dentro de una ventana de pares de bases de ±5. Para la distribución de lecturas (datos extendidos Fig. 6a) y mapas de calor (datos extendidos Fig. 6e, f), las réplicas se agruparon y se promediaron los recuentos de lectura sin procesar o normalizados por tamaño de biblioteca sobre las réplicas. La cobertura específica de cadena de lecturas de 5′P se calculó y representó como mapas de calor usando deepTools (v.3.3.2)61. Para el análisis diferencial de las lecturas de 5′P en diferentes funciones de anotación génica, las de cada función de anotación génica se enumeraron utilizando los recuentos de funciones del paquete R Rsubread (v.2.6.4)62,63. Los análisis diferenciales se realizaron utilizando edgeR (v.3.34.1)63.

Los motivos de escisión 5'P se calcularon a partir de la composición de la secuencia de las transcripciones, que involucran la región 4 nucleótidos aguas arriba y aguas abajo de las posiciones de mapeo 5' de todas las lecturas. Si varias lecturas se asignan a la misma posición, consideramos la composición base de esa región varias veces. Usando las frecuencias base obtenidas, luego procedimos a producir logotipos de secuencias con el paquete R ggseqlogo64, usando la entropía de Shannon (bits) para calcular la contribución de cada nucleótido en cada posición.

Los árboles taxonómicos se generaron con la herramienta graphlan (v.0.9.7) (https://huttenhower.sph.harvard.edu/graphlan). La información de linaje taxonómico para las 84 especies bacterianas identificadas en nuestras muestras se descargó de la base de datos de taxonomía del NCBI con el programa efetch de las utilidades electrónicas del NCBI. Los árboles se anotaron con información sobre el tamaño de la biblioteca, la periodicidad de 3 nt, el marco de protección de ribosomas preferido y la presencia de anotaciones enzimáticas para cada género (Datos complementarios 1). El tamaño de la biblioteca fue igual al número máximo de lecturas de ARNm por especie por muestra, en el rango de 0 a 1 (≥1 millón) de lecturas. La periodicidad de 3 nt se calculó teniendo en cuenta el valor absoluto de la señal FFT para la onda de periodicidad de 3 nt y la preferencia por el marco de protección del ribosoma, según lo calculado por el paquete de cinco pseq. Para FFT, se tomó el número máximo de señales para transcripciones alineadas al principio o al final. La preferencia por el marco de protección de los ribosomas se evaluó en función del valor de FPI, calculado por el paquete de cinco pseq como 2 × F/(∑1F1 − Fi), para cada marco Fi. El marco con el valor máximo absoluto de FPI se consideró como (mal) preferido, y la importancia de esta preferencia se evaluó en función de los valores P de la prueba t que comparan los recuentos en el marco dado con los otros dos combinados (los valores FPI y P se encuentran en el frame_stats.txt de la salida de fivepseq). Un valor FPI positivo significa que uno de los nucleótidos en cada codón en promedio tiene recuentos más altos (se prefiere) mientras que un valor negativo significa que uno de los nucleótidos en promedio tiene recuentos bajos (se prefiere incorrectamente) y los otros dos nucleótidos reciben recuentos más altos: por ejemplo, si se prefiere F1, tendrá un valor de FPI positivo y se resaltará en el árbol como un único marco de protección preferido, mientras que si, por ejemplo, se prefiere (incorrectamente) F2 (tiene un valor de FPI negativo), el árbol se resaltará F0 y F1 como fotogramas de preferencia. Los valores de FFT y FPI estaban en el rango de 0 a 1, y se tomó el máximo de los dos valores para describir la fuerza de la periodicidad de 3 nt. Las anotaciones de enzimas se obtuvieron de la base de datos EggNOG (v.5.0)65 La presencia de cada enzima en cada género se contó como un número entre 0 y 1, según la fracción de especies dentro del género anotadas con la enzima. El árbol resalta estos valores con la opacidad correspondiente.

El análisis funcional se realizó en listas de genes con abundancia diferencial o protección de marco diferencial entre condiciones de estrés y control. El FPI para cada transcrito se calculó como se describe anteriormente. El cambio de pliegue de los FPI se calculó como la diferencia en el FPI medio entre la condición de estrés/mutante y el control de tipo salvaje/no tratado para cada transcrito. La abundancia diferencial de los recuentos del punto final 5' para cada transcrito se calculó como la expresión log2 (cambio de pliegue) con el paquete DESeq2 R66 utilizando la estimación de contracción previa de la prueba t de Student adaptativa (apeglm).

El análisis de enriquecimiento del conjunto de genes se realizó con el paquete R WebGestaltR67 basado en la expresión diferencial de cambio de pliegue o los valores de FPI. Los archivos con formato GMT para cada especie se obtuvieron mediante la modificación de las anotaciones de proteínas Uniprot y se usaron como bases de datos de enriquecimiento. Los archivos GFF de anotación para cada especie se tomaron como base para la generación de las listas de genes de referencia. La importancia de los valores de P se calculó con una prueba hipergeométrica y se usó FDR para la corrección de pruebas múltiples.

La Junta Regional de Revisión Ética de Estocolmo (n.º 2017/725-31) autorizó la recolección y el procesamiento de muestras vaginales secuenciadas. La junta de revisión renunció a la aprobación ética de muestras y cultivos fecales porque solo se usaron muestras no identificadas de donantes sanos y no se almacenaron muestras en un biobanco. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes antes de la recolección de muestras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación están depositados en GEO con el número de acceso. GSE153497. Todos los archivos de salida de fivepseq generados en este estudio se depositan en el repositorio de datos de SciLifeLab: https://doi.org/10.17044/scilifelab.22284709. Las pistas de cobertura para muestras vaginales se depositan en https://doi.org/10.17044/scilifelab.22305991. Los datos de origen se depositan en Figshare en https://doi.org/10.17044/scilifelab.22305955.

El lanzamiento del código para el programa fivepseq v.1.2.0 está disponible en https://github.com/lilit-nersisyan/fivepseq/releases/tag/v1.2.0. Los scripts restantes y los archivos de datos de origen utilizados para generar las cifras se depositan en GitHub en https://github.com/lilit-nersisyan/Atlas-of-mRNA-translation-and-decay-for-bacteria/, versión v.1.0 (https://doi.org/10.17044/scilifelab.22305955).

Morris, C., Cluet, D. & Ricci, EP Dinámica de ribosomas y rotación de ARNm, una relación compleja bajo un escrutinio celular constante. Wiley Interdiscip. Rev. ARN 12, e1658 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Presnyak, V. et al. La optimización de codones es un determinante importante de la estabilidad del ARNm. Celda 160, 1111–1124 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boel, G. et al. La influencia de los codones en la expresión de proteínas en E. coli se correlaciona con los niveles de ARNm. Naturaleza 529, 358–363 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Huch, S. & Nissan, T. Interrelaciones entre la traducción y la degradación general del ARNm en levadura. Wiley Interdiscip. Rev. ARN 5, 747–763 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pelechano, V., Wei, W. & Steinmetz, LM La descomposición del ARN cotraduccional generalizada revela la dinámica de los ribosomas. Celda 161, 1400–1412 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tesina, P. et al. Estructura del complejo 80S ribosoma-Xrn1 nucleasa. Nat. Estructura. mol. Biol. 26, 275–280 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

McLaren, RS, Newbury, SF, Dance, GSC, Causton, HC & Higgins, CF degradación del ARNm por exoribonucleasas procesivas 3'-5' in vitro y las implicaciones para la descomposición del ARNm procariótico in vivo. J. Mol. Biol. 221, 81–95 (1991).

CAS PubMed Google Académico

Condon, C. & Bechhofer, DH Estabilidad regulada del ARN en los Gram positivos. actual Opinión Microbiol. 14, 148–154 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tejada-Arranz, A., de Crécy-Lagard, V. & de Reuse, H. Degradosomas de ARN bacteriano: máquinas moleculares bajo estricto control. Tendencias Bioquímica. ciencia 45, 42–57 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Deutscher, MP Degradación de ARN en bacterias: comparación de ARNm y ARN estable. Ácidos Nucleicos Res. 34, 659–666 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mathy, N. et al. Actividad exoribonucleasa 5' a 3' en bacterias: papel de la RNasa J1 en la maduración del ARNr y estabilidad 5' del ARNm. Celda 129, 681–692 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Saito, K. et al. Las colisiones de ribosomas inducen la escisión del ARNm y el rescate de ribosomas en bacterias. Naturaleza 603, 503–508 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pelechano, V., Wei, W. & Steinmetz, LM Cuantificación de todo el genoma de intermediarios de degradación de ARNm fosforilados en 5' para el análisis de la dinámica de los ribosomas. Nat. Protocolo 11, 359–376 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nersisyan, L., Ropat, M. y Pelechano, V. Análisis computacional mejorado de la dinámica de los ribosomas a partir de datos de degradoma 5'P utilizando fivepseq. Genoma NAR. Bioinformar. 2, lqaa099 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zhang, Y. & Pelechano, V. La secuenciación 5′P de alto rendimiento permite el estudio de las paradas de ribosomas asociadas a la degradación. Cell Rep. Métodos 1, 100001 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tesina, P. Estructura del complejo 80S ribosoma-nucleasa Xrn1. Nat. Estructura. mol. Biol. 26, 275–280 (2019).

Mohammad, F., Green, R. & Buskirk, AR Un método de perfilado de ribosomas revisado sistemáticamente para bacterias revela pausas en la resolución de un solo codón. eLife 8, 42591 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Lareau, LF, Hite, DH, Hogan, GJ & Brown, PO Distintas etapas del ciclo de elongación de la traducción reveladas mediante la secuenciación de fragmentos de ARNm protegidos por ribosomas. eLife 3, e01257 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Ingolia, NT, Ghaemmaghami, S., Newman, JRS y Weissman, JS Análisis in vivo de la traducción del genoma completo con resolución de nucleótidos utilizando perfiles de ribosomas. Ciencia 324, 218–223 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaberdin, VR, Singh, D. y Lin-Chao, S. Composición y conservación de la maquinaria de degradación de ARNm en bacterias. J. Biomédica. ciencia 18, 23 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaberdin, VR Sondeo de la especificidad de sustrato de Escherichia coli RNase E utilizando un nuevo ensayo basado en oligonucleótidos. Ácidos Nucleicos Res. 31, 4710–4716 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gill, EE et al. Detección de alto rendimiento del procesamiento de ARN en bacterias. BMC Genomics 19, 223 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Khemici, V., Prados, J., Linder, P. y Redder, P. La escisión endorribonucleolítica que inicia la descomposición por la RNasa Y se mantiene bajo un estricto control a través de la preferencia de secuencia y la localización subcelular. PLoS Genet. 11, e1005577 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Broglia, L. et al. Un enfoque comparativo basado en RNA-seq revela la interacción en todo el transcriptoma entre las exoRNasas de 3′ a 5′ y la RNasa Y. Nat. común 11, 1587 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cavaiuolo, M., Chagneau, C., Laalami, S. & Putzer, H. Impacto de la RNasa E y la RNasa J en el metabolismo global del ARNm en Cyanobacterium Synechocystis PCC6803. Frente. Microbiol. 11, 1055 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Lehnik-Habrink, M. et al. Procesamiento de ARN en Bacillus subtilis: identificación de dianas de la RNasa Y esencial. Mol. Microbiol. 81, 1459–1473 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Shahbabian, K., Jamalli, A., Zig, L. & Putzer, H. La RNasa Y, una nueva endoribonucleasa, inicia el recambio de ribointerruptores en Bacillus subtilis. EMBO J. 28, 3523–3533 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bloom, SM et al. La dependencia de cisteína de Lactobacillus iners es un objetivo terapéutico potencial para la modulación de la microbiota vaginal. Nat. Microbiol. 7, 434–450.

Glaasker, E., Konings, WN y Poolman, B. Flujos de betaína de glicina en Lactobacillus plantarum durante la osmostasia y el shock hiper e hipoosmótico. J. Biol. química 271, 10060–10065 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Choi, J. et al. Dinámica de la detención de la traducción específica del contexto por cloranfenicol y linezolid. Nat. química Biol. 16, 310–317 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Svetlov, MS et al. Acción específica del contexto de los antibióticos macrólidos en el ribosoma eucariota. Nat. común 12, 2803 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eh, D. et al. Una respuesta de agotamiento de tirosina-tRNA inducida por estrés media la represión traduccional basada en codones y la supresión del crecimiento. EMBO J. 40, e106696 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Trinquier, A. et al. Los defectos de maduración del ARNt conducen a la inhibición del procesamiento del ARNr a través de la síntesis de pppGpp. mol. Celda 74, 1227–1238 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hoffmann, T. et al. Control osmótico de la expresión de opuA en Bacillus subtilis y su modulación en respuesta a grupos intracelulares de glicina betaína y prolina. J. Bacteriol. 195, 510–522 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parker, DJ et al. Los niveles de aminoacil-tRNA sintetasa optimizados para el crecimiento evitan la carga máxima de tRNA. Sistema celular 11, 121–130 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Integrative, HMP The Integrative Human Microbiome Project: análisis dinámico de perfiles ómicos microbioma-huésped durante períodos de salud y enfermedad humana. Microbio huésped celular 16, 276–289 (2014).

Proctor, LM et al. El Proyecto Integrativo del Microbioma Humano. Naturaleza 569, 641–648 (2019).

Artículo Google Académico

Fremin, BJ, Sberro, H. & Bhatt, AS MetaRibo-Seq mide la traducción en microbiomas. Nat. común 11, 3268 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, GW, Burkhardt, D., Gross, C. & Weissman, JS La cuantificación de las tasas absolutas de síntesis de proteínas revela los principios subyacentes a la asignación de recursos celulares. Celda 157, 624–635 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. & Pelechano, V. Aplicación de la secuenciación 5′P de alto rendimiento para el estudio de la descomposición del ARNm cotraduccional. Protocolo ESTRELLA 2, 100447 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pelechano, V., Wei, W. & Steinmetz, LM Cuantificación de todo el genoma de intermediarios de degradación de ARNm fosforilados en 5′ para el análisis de la dinámica de los ribosomas. Nat. Protocolo 11, 359–376 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ährlund-Richter, A. et al. Cambios en la prevalencia del virus del papiloma humano (VPH) cervical en una clínica juvenil en Estocolmo, Suecia, una década después de la introducción de la vacuna contra el VPH. Frente. Infección celular. Microbiol. 9, 59 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Kannan, K. et al. El modo general de inhibición de la traducción por antibióticos macrólidos. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 111, 15958–15963 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Davis, AR, Gohara, DW & Yap, MNF Selectividad de secuencia de la atenuación traduccional inducida por macrólidos. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 111, 15379–15384 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arenz, S. & Wilson, DN Síntesis de proteínas bacterianas como objetivo para la inhibición de antibióticos. Harb de primavera fría. Perspectiva. Medicina. 6, a025361 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zhou, X., Willems, RJL, Friedrich, AW, Rossen, JWA y Bathoorn, E. Enterococcus faecium: desde conocimientos microbiológicos hasta recomendaciones prácticas para el control y diagnóstico de infecciones. Antimicrobiano Resistir. Infectar. Control 9, 130 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Subramaniam, AR et al. Un sensor de serina para la multicelularidad en una bacteria. eLife 2, e01501 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Schäfer, H. et al. Los alarmones (p)ppGpp son parte de la respuesta al choque térmico de Bacillus subtilis. PLoS Genet. 16, e1008275 (2020).

Serganov, A. & Nudler, E. Una década de riboswitches. Celda 152, 17–24 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vartoukian, SR Estrategias de cultivo para el crecimiento de bacterias no cultivadas. J. Oral Biosci. 58, 143–149 (2016).

Artículo Google Académico

Jahn, M. et al. El crecimiento de las cianobacterias está limitado por la abundancia de proteínas de asimilación de luz y carbono. Representante celular 25, 478–486 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fígaro, S. et al. Los mutantes de Bacillus subtilis con knockouts de los genes que codifican las ribonucleasas RNase Y y RNase J1 son viables, con defectos importantes en la morfología celular, la esporulación y la competencia. J. Bacteriol. 195, 2340–2348 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Domingo, MC, Huletsky, A., Giroux, R., Picard, FJ & Bergeron, MG vanD y grupos de genes similares a vanG en una especie de Ruminococcus aislada de la flora intestinal humana. Antimicrobiano Agentes Quimiotera. 51, 4111–4117 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Caponigro, G., Muhlrad, D. & Parker, R. Un pequeño segmento de la transcripción MAT alfa 1 promueve la descomposición del ARNm en Saccharomyces cerevisiae: un papel estimulante para codones raros. mol. Celúla. Biol. 13, 5141–5148 (1993).

Huch, S., Gommlich, J., Muppavarapu, M., Beckham, C. y Nissan, T. La asociación de membranas de los factores de decapado de ARNm es independiente del estrés en la levadura en ciernes. ciencia Rep. 6, 25477 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. & Pelechano, V. Aplicación de secuenciación 5'P de alto rendimiento para el estudio de la descomposición del ARNm cotraduccional. Protocolo ESTRELLA 2, 100447 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, H. et al. El formato de mapa/alineación de secuencias y SAMtools. Bioinformática 25, 2078–2079 (2009).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Smith, T., Heger, A. y Sudbery, I. Herramientas UMI: modelado de errores de secuenciación en identificadores moleculares únicos para mejorar la precisión de la cuantificación. Genoma Res. 27, 491–499 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Geissler, AS et al. BSGatlas: un atlas unificado de anotaciones de transcriptomas y genomas de Bacillus subtilis con acceso mejorado a la información. Microbio. genoma 7, 000524. (2021).

PubMed PubMed Central Google Académico

Santos-Zavaleta, A. et al. RegulonDB v 10.5: abordar los desafíos para unificar el conocimiento clásico y de alto rendimiento de la regulación génica en E. coli K-12. Ácidos Nucleicos Res. 47, D212–D220 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ramírez, F. et al. deepTools2: un servidor web de próxima generación para el análisis de datos de secuenciación profunda. Ácidos Nucleicos Res. 44, W160–W165 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Liao, Y., Smyth, GK & Shi, W. El paquete R Rsubread es más fácil, más rápido, más barato y mejor para la alineación y cuantificación de lecturas de secuenciación de ARN. Ácidos Nucleicos Res. 47, e47 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Robinson, MD, McCarthy, DJ y Smyth, GK edgeR: un paquete de bioconductores para el análisis de expresión diferencial de datos de expresión génica digital. Bioinformática 26, 139–140 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wagih, O. ggseqlogo: un paquete R versátil para dibujar logotipos de secuencias. Bioinformática 33, 3645–3647 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Huerta-Cepas, J. et al. eggNOG 5.0: un recurso ortológico jerárquico, funcional y filogenéticamente anotado basado en 5090 organismos y 2502 virus. Ácidos Nucleicos Res. 47, D309–D314 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Love, M., Huber, W. & Anders, S. Estimación moderada del cambio de pliegue y la dispersión para datos de RNA-seq con DESeq2. Genoma Biol. 15, 550 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Liao, Y., Wang, J., Jaehnig, EJ, Shi, Z. & Zhang, B. WebGestalt 2019: conjunto de herramientas de análisis de conjuntos de genes con IU y API renovadas. Ácidos Nucleicos Res. 47, W199–W205 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Damos las gracias a los miembros de los laboratorios Pelechano, Kutter y Friedländer y I. Piazza y V. Hauryliuk útil para los debates. Agradecemos a D. Omnus, J. Karlsen y F. Righetti por su ayuda, E. Loh, K. Jonas, P. Hudson, C. Condon y V. Hauryliuk por compartir cepas bacterianas y al laboratorio de Emmanuelle Charpentier por proporcionar el plásmido pEC622. . Este proyecto fue financiado por la Subvención Inicial de la Fundación Sueca (Fundación Ragnar Söderberg), el Consejo de Investigación Sueco (núms. VR 2016-01842, 2019-02335, 2020-01480 y 2021-06112), una Beca de la Academia Wallenberg (núm. 2016.0123) , Vinnova (n.º 2020-03620) y Karolinska Institutet (fondos SciLifeLab Fellowship, SFO y KI) a vicepresidente; el programa H2020-MSCA-IF-2018 de la UE (bajo el acuerdo de subvención n.° 845495 – TERMINATOR) y una subvención inicial del Comité Científico de MoESCS RA (n.° 21SCG-1F006) para LN; una beca posdoctoral RED (n.º 2021, SciLifeLab-KI) para MW; el Consejo Sueco de Investigación (núms. 2021-01683 y 2021-06112) a JD; la fundación Söderbergs a LE; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (n.º PGC2018-098073-A-I00 MCIU/AEI/FEDER, UE) a JH-C.; el Programa Nacional Clave de I+D de China (n.º 2017YFC0908405) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.º 81870187) a WW; y una subvención de investigador avanzado ERC (n.º 742804) para LMSVP y WW reconocen el apoyo de una subvención de movilidad conjunta entre China y Suecia de STINT (n.º CH2018-7750) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.º 81911530167), respectivamente. El análisis computacional se realizó con recursos proporcionados por la Infraestructura Nacional Sueca para Computación a través del Centro Multidisciplinario de Ciencias Computacionales Avanzadas de Uppsala, parcialmente financiado por el Consejo de Investigación Sueco a través del acuerdo de subvención no. 2018-05973.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por el Instituto Karolinska

Estos autores contribuyeron igualmente: Susanne Huch, Lilit Nersisyan.

SciLifeLab, Departamento de Microbiología, Tumor y Biología Celular, Karolinska Institutet, Solna, Suecia

Susanne Huch, Lilit Nersisyan, Maria Ropat, Donal Barrett, Mengjun Wu & Vicent Pelechano

Instituto Armenio de Bioinformática, Ereván, Armenia

Lilit Nersisyan y Nelli Vardazaryan

Instituto de Biología Molecular, Academia Nacional de Ciencias de Armenia, Ereván, Armenia

Lilit Nersisyan y Nelli Vardazaryan

Departamento de Microbiología, Tumor y Biología Celular, Centro de Investigación Traslacional del Microbioma, Instituto Karolinska, Estocolmo, Suecia

Jing Wang, Valerie D. Valeriano, Juan Du y Lars Engstrand

Centro de Biotecnologia y Genomica de Plantas, Universidad Politécnica de Madrid – Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria, Campus de Montegancedo-UPM, Madrid, Spain

Jaime Huerta-Cepas

Bio-Med Big Data Center, CAS Key Laboratory of Computational Biology, Instituto de Nutrición y Salud de Shanghái, Academia de Ciencias de la Universidad de China, Academia de Ciencias de China, Shanghái, China

wu wei

Centro de Tecnología del Genoma de Stanford, Universidad de Stanford, Palo Alto, CA, EE. UU.

Lars M. Steinmetz

Departamento de Genética, Facultad de Medicina, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Lars M. Steinmetz

Laboratorio Europeo de Biología Molecular, Unidad de Biología del Genoma, Heidelberg, Alemania

Lars M. Steinmetz

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

VP, SH y LN concebido y diseñado el estudio. SH realizó trabajos experimentales con el apoyo de DB, JW y VDVLN, SH, MR y MW realizaron análisis de datos con el apoyo de JH-C. y DBWW y LMS contribuyeron a la conceptualización inicial y la interpretación de datos. LE y JD contribuyeron a la interpretación, el diseño y la supervisión de los datos. SH, LN y VP redactaron el manuscrito inicial y todos los autores lo revisaron. VP supervisó el estudio.

Correspondence to Vicent Pelechano.

VP, SH y LN son cofundadores de 3 N Bio AB, que ha presentado una solicitud de patente con respecto a parte del trabajo descrito en este manuscrito. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Microbiology agradece a Irina Artsimovitch y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

A, Protección de 3 nt específica de gen para B. subtilis según lo informado por fivepseq14. Cada punto corresponde a un gen y la proximidad a los límites del triángulo (F0, F1 o F2) su marco de protección preferencial. Las células de control NT se muestran en verde, los intermedios de degradación de ARNm asociados con polirribosomas en azul, las células tratadas con CAM en amarillo y fragmentadas al azar en rojo. B, análisis del metagen 5PSeq de B. subtilis después del aislamiento de la fracción de polirribosomas (como en la Fig. 1).

AL, análisis de Metagene para múltiples especies que muestran protección 5PSeq de metagene, transformada rápida de Fourier (FFT), protección de marco relativo y RNasas identificadas (como en la Fig. 1).

A, NT y controles fragmentados de cepas de tipo salvaje de B. subtilis (168 trpC2), así como cepas knock-out rnjA, rnjB. B Cepas de B. subtilis mutantes de RNasa y de tipo salvaje bajo choque térmico. C. Control NT y muestras fragmentadas de E. coli cepa Dh5α y TOP10 con expresión heteróloga de S. pyogenes RNJA. La preferencia del motivo de escisión se calculó con la medida de contribución de nucleótidos basada en la entropía de Shannon (como en la Fig. 1C).

Gráficos de líneas que muestran pausas de ribosomas específicas de aminoácidos medidas por cinco pseq. A, Pausa de isoleucina (Ile) (-14 nt) comparando el tratamiento con NT y MUP en L. plantarum, L. reuteri y B. subtilis. B, Las pausas relativas del ribosoma de alanina (Ala) y serina (Ser) específicas del contexto (-8 nt) medidas por cinco pseq para múltiples especies en respuesta a CAM. Solo en E. coli, que carece de RNasa J, el perfil de degradoma 5´P no proporciona información de resolución de un solo nucleótido de la parada del ribosoma. CD, gráficos de análisis de componentes principales basados ​​en recuentos de 5P 14 nt aguas arriba de cada codón para L. plantarum y B. subtilis en condiciones de estrés. Las muestras de control de NT de B. subtilis se han recogido en diferentes fases de crecimiento (OD600 0,2-0,3 y 0,6-0,8 respectivamente). La contribución de cada codón se muestra con vectores de carga grises. Se destacan las características con las cargas más largas correspondientes a las de mayor peso absoluto en PC1 y PC2. Las flechas hacia arriba en las etiquetas indican que los recuentos de 5P aumentan en condiciones de estrés para el codón. Los codones de aminoácidos comunes entre L. plantarum y B. subtilis se destacan con colores específicos de estrés. EF, pausas relativas de Arg y Gln (-14 nt) en el crecimiento en fase estacionaria para L. plantarum (27 horas) y B. subtilis (8 días).

Al realizar el análisis de enriquecimiento, se considera el cambio de pliegue log2 de las lecturas que experimentan degradación en el estrés en comparación con las muestras no tratadas (abundancia relativa) o el cambio de pliegue log2 del índice de protección del marco (FPI). Solo se muestran los resultados con una tasa de detección falsa de <0,05. AB subtilis y E. coli en choque térmico. BB subtilis en alta salinidad. CB subtilis y L. plantarum en crecimiento estacionario.

A, Gráficos de barras que muestran el porcentaje (%) (eje Y) de lecturas de 5' P que se superponen a una característica de anotación génica dada para cepas de B. subtilis (izquierda) y E. coli (panel derecho) en condiciones normales y perturbadas. Las lecturas de ARNr contaminante se excluyeron del análisis. B, análisis de componentes principales basado en lecturas de 5' P normalizadas de tamaño de biblioteca en la escala logarítmica natural del control de B. subtilis y diferentes caídas de RNasa. Los ejes representan los componentes principales 1 y 2. C, mapa de calor que muestra el cambio de log2 veces en 5' P lee la abundancia de miscRNAs para RNase knockouts frente a la cepa de B. subtilis de tipo salvaje. D, como C pero para UTR de 5'. E, Mapas de calor que muestran la cobertura específica de cadena de lecturas de 5' P normalizadas de tamaño de biblioteca centradas alrededor del sitio final (TES) de 5' UTR (en este caso, el codón de inicio) para el control de B. subtilis y diferentes knockouts de RNase. Cada fila del mapa de calor muestra una UTR de 5'. La línea discontinua indica el sitio de inicio de las UTR de 5' (es decir, los TSS). F, como E, pero para E.coli.

A, número relativo de lecturas mapeadas de forma única (escaladas dentro de cada muestra) en función de la longitud de lectura utilizada (recortada computacionalmente). B, análisis de 5PSeq de suspensión de células congeladas del estándar comunitario microbiano ZymoBIOMICS (destinado a análisis de ADN). Los números de lecturas asignadas a cada especie están marcados en círculos. Marco de protección relativo y transformada rápida de Fourier (FFT), y presencia/ausencia de enzimas como en la figura 1. C, análisis 5PSeq de microbiomas fecales. Los números de lecturas asignadas están marcados en círculos. Ejemplo de periodicidad de protección de ribosomas de 3 nt específica de aminoácido (Ala) in vivo para especies seleccionadas. D, lo mismo para el microbioma del compost.

A, Composición relativa de los cultivos fecales utilizados basada en la abundancia de ADN genómico. B, Gráficos lineales que muestran la abundancia del metagen 5PSeq con respecto a las características seleccionadas que ilustran la respuesta diferencial específica de la especie según el cultivo de origen. C. Ejemplo de Bacillota E. faecium que muestra poca respuesta al tratamiento farmacológico aplicado. D, especies de Bacteroidota, carentes de RNasa J, también presentan claras alteraciones del perfil del degradoma 5´P en respuesta al tratamiento farmacológico.

Figs suplementarias. 1–8, descripciones de las tablas 1–7 y escaneos de geles sin recortar.

Tabla 1: oligonucleótidos utilizados en este estudio. Tabla 2: resumen de muestras y bibliotecas analizadas en este estudio. Tabla 3: valores de log2 (veces de cambio) de la abundancia relativa de lecturas que experimentan degradación y valores de FPI para cada gen y análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes basados ​​en ontología génica en condiciones de estrés frente a condiciones no tratadas para B. subtilis (subsp. subtilis 168trpC2), E. coli (cepa MG1655) y L. plantarum. Los valores de P de enriquecimiento se calcularon con una prueba hipergeométrica y el ajuste de prueba múltiple se realizó con FDR y el paquete R WebGestaltR. Tabla 4: efecto de la desactivación de RNasa en la abundancia de ARN procedente de diferentes características genómicas en B. subtilis. La tabla incluye log2 (cambio de pliegue) para UTR, TSS, regiones de codificación y varios ARN y ARNt. Tabla 5: lista de 5.804 ensamblajes de genomas procarióticos recuperados del NCBI y utilizados para la alineación. Tabla 6: lista de especies con cobertura relativamente alta identificadas en todas las muestras estudiadas. Tabla 7: expresión estimada de RNasas utilizando 5P-seq en las muestras estudiadas, en RPM.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Huch, S., Nersisyan, L., Ropat, M. et al. Atlas de traducción y descomposición de ARNm para bacterias. Nat Microbiol 8, 1123–1136 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01393-z

Descargar cita

Recibido: 16 junio 2022

Aceptado: 19 de abril de 2023

Publicado: 22 mayo 2023

Fecha de emisión: junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01393-z

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt